名師講堂第二講精彩問(wèn)答集錦
問(wèn)：請(qǐng)問(wèn)為什么直徑提高十倍，強(qiáng)度為什么也是提高十倍，不應(yīng)該是是提高10的三次方倍嗎？謝謝
答：謝謝！我們描述定量問(wèn)題的結(jié)果是二維投影圖，在二維投影圖中，事實(shí)上我們是將沿著貝塞爾光傳輸路徑上產(chǎn)生的SRS信號(hào)進(jìn)行了累積，因此是沿著直徑方向的累積，所以強(qiáng)度相差應(yīng)該是10倍。
問(wèn)：儀器使用的軟件后期升級(jí)需要自己購(gòu)買嗎？
謝謝您的關(guān)注。我們目前的儀器還沒(méi)有商業(yè)化，只是實(shí)驗(yàn)室科研開(kāi)發(fā)的儀器和配套軟件。如果有需要，我們可以提供使用或者部分算法源代碼。
問(wèn)：陳老師，所以用貝塞爾投影拉曼成像，想得到表層的樣品信息，就是必須旋轉(zhuǎn)樣品，然后后期軟件來(lái)算的是嗎？
答：謝謝！是這樣的。如果不采用旋轉(zhuǎn)斷層策略的話，我們得到的是一定深度內(nèi)的信息；只有通過(guò)樣本旋轉(zhuǎn)，然后利用斷層重建算法將樣品的三維信息恢復(fù)出來(lái)，我們就可以得到樣品的三維體積內(nèi)所有位置的拉曼散射信息。
問(wèn)：陳老師，好！請(qǐng)問(wèn)內(nèi)窺拉曼和內(nèi)窺熒光在活檢臨床上的應(yīng)用，例如在腫瘤檢測(cè)方面的應(yīng)用概況是怎樣的？
答：謝謝！據(jù)我所了解的(也有可能不完全準(zhǔn)確)，無(wú)論是內(nèi)窺拉曼還是內(nèi)窺熒光還都沒(méi)有真正應(yīng)用于臨床活檢上，更多的還是探索性的研究。內(nèi)窺拉曼的優(yōu)勢(shì)在于不需要熒光標(biāo)記，從而不需要引入外源物，能更快的應(yīng)用于臨床；但它的缺點(diǎn)是信號(hào)比較弱，在生物體特別是人體臨床應(yīng)用的復(fù)雜環(huán)境下，能否采集到有效的拉曼信號(hào)是個(gè)問(wèn)題。
問(wèn)：陳老師，好！請(qǐng)教一下，共焦熒光成像和共焦拉曼成像，在實(shí)際應(yīng)用方面各有什么樣的優(yōu)缺點(diǎn)？
答：謝謝！共聚焦熒光成像在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域還是公認(rèn)的重要工具，這點(diǎn)目前共聚焦拉曼還取代不了。共聚焦熒光成像由于我們是用熒光染料或蛋白標(biāo)記了我們想看的成分或分子，所以熒光顯示的就是我們想看的東西；而共聚焦拉曼由于是無(wú)標(biāo)記成像，因此需要同時(shí)結(jié)合拉曼光譜來(lái)確認(rèn)我們看到的是什么，這也會(huì)造成數(shù)據(jù)采集時(shí)間會(huì)比較長(zhǎng)。
問(wèn)：陳老師，好！請(qǐng)教一下，貝塞爾光束拉曼成像，在走向儀器商用化過(guò)程中，會(huì)遇到什么樣的困難？
答：謝謝！這可能需要從SRS和拉曼光譜檢測(cè)兩個(gè)方面來(lái)說(shuō)。從SRS技術(shù)來(lái)看，目前已經(jīng)有基于高斯光束的商業(yè)化的SRS設(shè)備，但設(shè)備體積比較龐大、價(jià)格比較昂貴，而基于拜爾光束的話，只需要增加環(huán)形光產(chǎn)生模塊即可；這個(gè)設(shè)備商業(yè)化的困難包括兩部分：一個(gè)是如何將設(shè)備體積縮小，一個(gè)是如何將成本降低；而光纖激光器可能是一個(gè)比較好的選擇。在自發(fā)拉曼光譜檢測(cè)中，貝塞爾光束拉曼光譜儀商業(yè)化遇到的問(wèn)題可能是設(shè)備小型化、以及如何在小型化情況下產(chǎn)生高質(zhì)量的貝塞爾光。
問(wèn)：陳老師，您好！目前基于貝塞爾光束的拉曼成像橫向分辨率和徑向分辨率能達(dá)到什么數(shù)量級(jí)？成像速度能能達(dá)到多少？對(duì)樣品是否有要求，比如透明樣品或非透明樣品，對(duì)樣品的制備、探測(cè)，有什么注意事項(xiàng)？
答：謝謝！目前基于貝塞爾光的受激拉曼投影成像系統(tǒng)橫向分辨率大概在0.8-0.9微米(40X物鏡)。系統(tǒng)的橫向分辨率是與采用的物鏡相關(guān)的，并且需要與待測(cè)樣本厚度之間達(dá)到一個(gè)平衡；或者說(shuō)我們可以通過(guò)高倍、大NA的物鏡獲得更高的分辨率， 但是能夠測(cè)量樣本的厚度或者體積會(huì)變小。受激拉曼投影成像是沒(méi)有徑向分辨率的，不過(guò)我們可以通過(guò)結(jié)合樣本旋轉(zhuǎn)、采用斷層重建的方式進(jìn)行恢復(fù)，理論上應(yīng)該是與橫向分辨率相同的。目前成像速度是在1秒一張投影圖，獲取三維體積的話需要采集180張投影，所以大概在180秒；結(jié)合我們后面開(kāi)發(fā)的稀疏數(shù)據(jù)重建算法，可以將這個(gè)時(shí)間縮小到15秒左右。樣品需要是透明或者半透明的樣品，所以一般用于斑馬魚(yú)、線蟲(chóng)、果蠅等模式生物的檢測(cè)與成像。實(shí)驗(yàn)中，樣品的固定需要采用特定的方式，我們目前正在開(kāi)發(fā)適用于這種成像方式的樣本固定裝置。
問(wèn)：陳老師，所以用貝塞爾投影拉曼成像，想得到表層的樣品信息，就是必須旋轉(zhuǎn)樣品，然后后期軟件來(lái)算的是嗎？
答：謝謝！是這樣的。如果不采用旋轉(zhuǎn)斷層策略的話，我們得到的是一定深度內(nèi)的信息；只有通過(guò)樣本旋轉(zhuǎn)，然后利用斷層重建算法將樣品的三維信息恢復(fù)出來(lái)，我們就可以得到樣品的三維體積內(nèi)所有位置的拉曼散射信息。
同問(wèn)：請(qǐng)問(wèn)為什么直徑提高十倍，強(qiáng)度為什么也是提高十倍，不應(yīng)該是是提高10的三次方倍嗎？謝謝
答：謝謝！我們描述定量問(wèn)題的結(jié)果是二維投影圖，在二維投影圖中，事實(shí)上我們是將沿著貝塞爾光傳輸路徑上產(chǎn)生的SRS信號(hào)進(jìn)行了累積，因此是沿著直徑方向的累積，所以強(qiáng)度相差應(yīng)該是10倍。
問(wèn)：陳老師，您好！請(qǐng)教一下：1）樣品一般最厚可以多厚？樣品厚度對(duì)光譜信號(hào)的影響，如信號(hào)的衰減，二次散射、雜散信號(hào)等方面。2）樣品是冷凍切片嗎？
答：謝謝！1）在受激拉曼投影斷層成像中，能檢測(cè)的樣品的厚度是取決于物鏡，或者說(shuō)取決于分辨率的需求。如果對(duì)分辨率要求比較高，能觀測(cè)的樣品厚度較小。在我們發(fā)表的工作中，有一個(gè)表格專門列了不同物鏡能夠觀測(cè)的樣品厚度。比如，如果選用60X/1.1NA物鏡，樣品厚度大概在400微米，分辨率大概在0.34微米；如果選用10X/0.3NA物鏡，樣品厚度可以達(dá)到8個(gè)毫米以上，分辨率大概在1.55微米。
2）樣品不是冰凍切片。關(guān)于樣品的詳細(xì)信息，可以查閱我們文章中的描述。謝謝！
問(wèn)：陳老師你好，為什么光譜位置跟激發(fā)光有關(guān)呢。
答：謝謝！光譜特征譜峰的位置理論上是與激發(fā)光無(wú)關(guān)。我們采用貝塞爾光拉曼光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)時(shí)，由于技術(shù)是一種新技術(shù)、并且設(shè)備是我們自己搭建的，所以我們需要對(duì)設(shè)備檢測(cè)拉曼光譜的能力和性能進(jìn)行驗(yàn)證；而實(shí)驗(yàn)中，測(cè)量到的拉曼光譜的譜峰位置很難做到跟標(biāo)準(zhǔn)譜完全一致，我們目前的結(jié)果是有一些誤差，但這個(gè)誤差是在光譜儀的分辨率范圍內(nèi)的。或者說(shuō)我們的光譜儀分辨率大概在9個(gè)波數(shù)，而我們測(cè)量到的譜峰與標(biāo)準(zhǔn)譜峰位置差異都是小于9個(gè)波數(shù)。
問(wèn)：陳老師，您剛講的高斯光轉(zhuǎn)換為貝塞爾光束這部分，實(shí)現(xiàn)上有什么注意事項(xiàng)？
答：謝謝！需要注意的地方就是產(chǎn)生的貝塞爾光的質(zhì)量，這會(huì)受到Axicon前端入射的高斯光質(zhì)量、經(jīng)兩個(gè)Axicon產(chǎn)生的環(huán)形光的質(zhì)量、以及環(huán)形光入射物鏡時(shí)的狀態(tài)影響。
問(wèn)：還有一個(gè)問(wèn)題，之前的拉曼成像，你們用的是光譜儀取的拉曼信號(hào)么？
答：謝謝！在受激拉曼投影成像中，我們是用光二極管進(jìn)行拉曼信號(hào)的收集和提取。在第三部分的拉曼光譜檢測(cè)中是用的光譜儀。
問(wèn)：如何對(duì)貝塞爾光束的強(qiáng)度進(jìn)行判定？是記錄使用時(shí)間？還是計(jì)量光照度？
答：謝謝！我們用功率來(lái)衡量強(qiáng)度，通過(guò)功率計(jì)來(lái)測(cè)量貝塞爾光的功率。
問(wèn)：貝塞爾光束和高斯光束對(duì)樣品的損傷區(qū)別
答：謝謝！如果在相同的總功率情況下，貝塞爾光對(duì)樣品的損傷會(huì)比高斯光小很多。貝塞爾光從結(jié)構(gòu)上是由一個(gè)中心lobe和多個(gè)旁瓣組成，并且能量是在中心lobe和旁瓣上平均分配，所以能夠聚焦到樣品上的能量只有中心lobe的，這個(gè)能量/功率是高斯光的1/12左右。在熒光成像領(lǐng)域，有學(xué)者對(duì)這個(gè)問(wèn)題做個(gè)研究，而這也是貝塞爾光相比于高斯光的優(yōu)勢(shì)之一。
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